細(xì)胞灌注培養(yǎng)用Cellgard細(xì)胞截留板—邁博瑞一次性生物反應(yīng)器耗材新品上線
標(biāo)簽：
隨著國內(nèi)生物制藥行業(yè)的迅速發(fā)展，細(xì)胞灌注培養(yǎng)越來越受到人們關(guān)注，因為其可以在較小體積的生物反應(yīng)器中獲得高的細(xì)胞密度，其中細(xì)胞截留裝置是灌流培養(yǎng)工藝開發(fā)非常關(guān)鍵的一項，邁博瑞基于常年在過濾、分離及純化行業(yè)的積累，提出了利用深層過濾機制來應(yīng)對灌流生物反應(yīng)袋過濾部件提出的挑戰(zhàn)，并成功開發(fā)出Cellgard細(xì)胞截留板。
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1.一次性生物反應(yīng)袋發(fā)展進程
2.一次性灌流生物反應(yīng)袋的基本要求 3.一次性灌流生物反應(yīng)袋應(yīng)用及挑戰(zhàn)
4.邁博瑞Cellgard細(xì)胞截留板
6.邁博瑞Cellgard細(xì)胞截留板的優(yōu)勢 |
一、一次性生物反應(yīng)袋發(fā)展進程
1、一次性生物反應(yīng)袋
1998年，Wave Biotech公司推出了Wave Bioreactor®搖擺式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，該系統(tǒng)采用一次性生物反應(yīng)袋Cellbag®作為細(xì)胞及微生物培養(yǎng)容器。經(jīng)過市場多年的使用驗證，一次性搖擺式生物反應(yīng)器系統(tǒng)及其所配套的耗材，已經(jīng)在全球范圍內(nèi)得到廣泛的接受與認(rèn)可。隨著生命科學(xué)及生物制藥行業(yè)的快速發(fā)展，行業(yè)主體對細(xì)胞培養(yǎng)的要求越來越高，更高的細(xì)胞培養(yǎng)密度、更短的培養(yǎng)周期、更低的培養(yǎng)成本、更高的培養(yǎng)成功率等。因此，一次性生物反應(yīng)器耗材制備技術(shù)、生物培養(yǎng)工藝等學(xué)科也在不斷發(fā)展，更新迭代。
圖1：®示意圖（圖片來自GE）
2、帶過濾器的一次性生物反應(yīng)袋
2001年，Dr. Vijay Singh發(fā)明了帶過濾器的一次性生物反應(yīng)袋產(chǎn)品，見圖2（專利號US6544788），該產(chǎn)品能夠?qū)⒛繕?biāo)物質(zhì)，如細(xì)胞、微生物等，通過所述的“過濾器”截留在反應(yīng)袋內(nèi)部，同時將廢培養(yǎng)基液體通過“過濾器”排出反應(yīng)器外，并且實現(xiàn)新鮮培養(yǎng)基加入，從而實現(xiàn)了在Wave Bioreactor®及一次性反應(yīng)袋產(chǎn)品中連續(xù)化灌注培養(yǎng)細(xì)胞及微生物，為微生物培養(yǎng)工藝、生物制藥上游細(xì)胞擴增工藝提供了有力的工具。
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圖2：帶過濾器的一次性生物反應(yīng)袋示意圖（圖片來源：US6544788）
3、一次性灌流生物反應(yīng)袋
該技術(shù)發(fā)展到今天，最為行業(yè)所熟知的產(chǎn)品，即為Cytiva公司在售的XuriTM系列一次性灌流生物反應(yīng)袋產(chǎn)品，見圖3。隨著專利US6544788的到期，全球一次性耗材生產(chǎn)商也陸陸續(xù)續(xù)開始了一次性灌流生物反應(yīng)袋產(chǎn)品的開發(fā)和商業(yè)化工作。
圖3：XuriTM系列一次性灌流生物反應(yīng)袋產(chǎn)品（圖片來自Cytiva）
二、一次性灌流生物反應(yīng)袋的基本要求
一次性灌流生物反應(yīng)袋的基本要求，是在產(chǎn)品使用者的生物培養(yǎng)工藝條件下，保證所培養(yǎng)的微生物或細(xì)胞，達到預(yù)期的增殖密度，且在該過程中，起到截留作用的“過濾器”不堵塞，即液體能夠在較低的壓力下通過所述過濾裝置，同時，“過濾器”能夠有效截留被培養(yǎng)物質(zhì)，即過濾裝置下游幾乎無微生物或細(xì)胞穿透。因此，由上述可見，“過濾器”的截留性能是決定一次性灌流生物反應(yīng)袋能否滿足使用要求的關(guān)鍵核心部件。
三、一次性灌流生物反應(yīng)袋應(yīng)用及挑戰(zhàn)
1、一次性灌流生物反應(yīng)袋主要應(yīng)用
- 一次性灌流生物反應(yīng)袋的一個重要應(yīng)用點，位于生物制藥工藝環(huán)節(jié)中的細(xì)胞擴增工藝段。
- 在細(xì)胞擴增階段，使用者期望能夠通過灌流培養(yǎng)的工藝，實現(xiàn)對于CHO等工程細(xì)胞的高密度細(xì)胞培養(yǎng)。
高密度CHO細(xì)胞灌流培養(yǎng)的益處為：
- 一方面，可以提高細(xì)胞擴增效率，甚至有可能減少1-2個細(xì)胞擴增工藝步驟，節(jié)省時間、原材料、金錢、人力成本，減少染菌風(fēng)險，提高成功率
- 另一方面，在一些利用工程細(xì)胞表達目標(biāo)蛋白、收獲病毒載體、獲得mRNA疫苗的小規(guī)模研產(chǎn)活動中，高細(xì)胞培養(yǎng)密度能夠帶來更高的目標(biāo)物滴度，并提高效率
下圖4比較了一個用常規(guī)方法將細(xì)胞擴大到500L生產(chǎn)用生物反應(yīng)器（n）中的例子，使用高密度細(xì)胞庫方法減少了中間兩個轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的步驟，可以直接接種到2L的波浪生物反應(yīng)器中。使用波浪生物反應(yīng)器（2L和20L）代替轉(zhuǎn)瓶（125ml到10L）大大減少了需要在超凈臺中操作的次數(shù)。這種替換使整個過程在一個封閉系統(tǒng)中進行，提高了操作成功率。
圖4：常規(guī)與改進的細(xì)胞培養(yǎng)工藝過程比較（圖片來源：Bioprocess Int）
2、一次性灌流生物反應(yīng)袋在高細(xì)胞密度中面臨的挑戰(zhàn)
高細(xì)胞密度對于灌流生物反應(yīng)袋的挑戰(zhàn)是巨大的，尤其當(dāng)細(xì)胞密度上升后，對于過濾部件的壓力尤為明顯。
- 高細(xì)胞濃度時，過濾部件需要能夠維持灌流工藝的進行，此即要求過濾部件面對高濃度料液挑戰(zhàn)時不被堵塞；
- 再者，被培養(yǎng)物，如細(xì)胞、微生物等由于本身結(jié)構(gòu)柔軟，在較低壓力驅(qū)動下極容易穿透過濾介質(zhì)。
- 另外一個容易被忽視的地方，在于灌流生物反應(yīng)袋中的過濾部件在整個培養(yǎng)過程中是隨著Wave Bioreactor®不斷“隨波逐流”的，長時間的培養(yǎng)需求對過濾部件的機械可靠性能提出了更高的要求。
綜上，一款合格的適用于Wave Bioreactor®的截留過濾部件需要滿足高載量、長壽命、高截留效率、高機械可靠性等要求。邁博瑞基于常年在過濾、分離及純化行業(yè)的積累，提出了利用深層過濾機制來應(yīng)對灌流生物反應(yīng)袋過濾部件提出的挑戰(zhàn)，并成功開發(fā)出Cellgard細(xì)胞截留板。
三、邁博瑞Cellgard細(xì)胞截留板
邁博瑞開發(fā)的Cellgard細(xì)胞截留板是利用超高分子量聚乙烯粉末燒結(jié)工藝制成的一種深層過濾介質(zhì)，見圖5，有17×17cm和50×30cm兩種尺寸，厚度為3mm，見圖6。針對生物制藥行業(yè)對于工程細(xì)胞（如CHO DG44細(xì)胞，CHO K1細(xì)胞，HEK 293細(xì)胞等）擴增培養(yǎng)的具體需求，Cellgard板材的孔徑被設(shè)計為7μm，同時，Cellgard高達300N/mm的穿刺強度，大大提高了截留部件的機械可靠性。這樣的設(shè)計，能夠良好的滿足灌流生物反應(yīng)袋對截留過濾部件提出的挑戰(zhàn)。在MS與客戶的灌流細(xì)胞培養(yǎng)評測實驗中，Cellgard細(xì)胞截留板均完美的實現(xiàn)了不同條件下的細(xì)胞培養(yǎng)并達到測試預(yù)期。
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圖5：MS Cellgard細(xì)胞截留板 |
圖6：MS Cellgard細(xì)胞截留板尺寸示意圖 |
四、Cellgard細(xì)胞截留板性能實驗分析
實驗一：2L細(xì)胞培養(yǎng)
圖7：灌流式生物反應(yīng)袋結(jié)構(gòu)示意圖
在第一組測試中，尺寸為17×17cm2的Cellgard細(xì)胞截留板被制作成2L灌流式生物反應(yīng)袋（見上示意圖7）。該測試主要考察樣品灌流袋在未有蛋白表達情況下的細(xì)胞擴增情況，所用細(xì)胞株為CHO K1。在設(shè)置的另外兩組平行實驗中，同樣規(guī)格大小的兩個2L灌流反應(yīng)袋分別裝載標(biāo)稱孔徑1微米的微濾膜及競品細(xì)胞截留板作為灌流過濾部件。該測試約定，當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞泄露、截留板堵塞、細(xì)胞活率下降至90%以下等情況時，停止實驗。
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在為期8天的培養(yǎng)過程中，裝配有Cellgard細(xì)胞截留板的反應(yīng)袋中的細(xì)胞濃度順利增殖到近120 M/ml的濃度，Day 7-8的培養(yǎng)中，跨膜壓差略微上升，細(xì)胞活率略下降，但是膜后收獲液未見細(xì)胞泄露，與平行對照組相比，同期細(xì)胞活率未見明顯區(qū)別， |
裝載微濾膜的反應(yīng)袋Day 5出現(xiàn)嚴(yán)重的堵塞現(xiàn)象且下游伴隨約30%的細(xì)胞泄露，細(xì)胞活率較好， |
裝載有競品截留板的反應(yīng)袋Day 3出現(xiàn)細(xì)胞泄露，至Day 5時，泄露率達30%以上，細(xì)胞活率維持較好， |
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圖8：Cellgard 2L WAVE 培養(yǎng)天數(shù)與細(xì)胞密度、細(xì)胞活率、跨膜壓差、細(xì)胞泄露趨勢圖 |
圖9：微濾膜 2L WAVE 培養(yǎng)天數(shù)與細(xì)胞密度、細(xì)胞活率、跨膜壓差、細(xì)胞泄露趨勢圖 |
圖10：競品截留板 2L WAVE 培養(yǎng)天數(shù)與細(xì)胞密度、細(xì)胞活率、跨膜壓差、細(xì)胞泄露趨勢圖 |
實驗二：50L細(xì)胞培養(yǎng)
第二組測試主要考察被培養(yǎng)的細(xì)胞在表達蛋白的情況下，Cellgard截留板作為過濾部件的表現(xiàn)。所用Cellgard截留板尺寸為30×50cm2，反應(yīng)袋體積為50L。該培養(yǎng)實驗的預(yù)設(shè)目標(biāo)，是利用灌流式生物反應(yīng)袋將CHO細(xì)胞培養(yǎng)至70 M/ml的細(xì)胞濃度，并至少維持5天以上，同時觀察蛋白表達及收獲液中的蛋白收率情況
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本次培養(yǎng)起始階段細(xì)胞接種密度為0.3 M/ml，3天后細(xì)胞順利進入對數(shù)生長期，到Day 10時達到最高細(xì)胞密度84.7 M/ml。經(jīng)灌流速率、供養(yǎng)等參數(shù)調(diào)控后，培養(yǎng)密度順利維持在70 M/ml以上并保持較高的細(xì)胞活率， |
同時，細(xì)胞蛋白表達亦進入對應(yīng)的高峰期。經(jīng)測量反應(yīng)袋內(nèi)及截留板下游蛋白濃度，可得收獲端蛋白收獲率。Cellgard細(xì)胞截留板上下游幾乎無法測出蛋白濃度差，蛋白收獲率近100%，見圖12。該特性相較利用微濾膜、超濾膜技術(shù)實現(xiàn)灌流功能的器件相比，具有獨特的優(yōu)勢。 |
灌流培養(yǎng)進行至Day 18時，Cellgard細(xì)胞截留板下游開始探測到有活細(xì)胞穿透，此時對應(yīng)的跨膜壓差增長到50mbar。隨著灌流培養(yǎng)繼續(xù)進行，跨膜壓差繼續(xù)增長，細(xì)胞穿透更加明顯，而細(xì)胞蛋白表達及下游收獲率幾乎不受影響，見圖13。細(xì)胞穿透的原因一般是由于跨膜壓差的驅(qū)動使得細(xì)胞發(fā)生了形變而穿越了截留板的微孔結(jié)構(gòu)。我們建議用戶在實際培養(yǎng)過程中監(jiān)控跨膜壓差，并根據(jù)實際培養(yǎng)情況調(diào)整培養(yǎng)工藝。 |
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圖11：50L灌流袋細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)與細(xì)胞密度、細(xì)胞活率趨勢圖 |
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圖12：50L灌流袋細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)與mAB濃度、mAB收獲率趨勢圖
圖13：50L灌流袋細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)與跨膜壓力、收獲液細(xì)胞密度趨勢圖
至此，在兩種不同培養(yǎng)工藝條件下，Cellgard截留板均實現(xiàn)了高細(xì)胞培養(yǎng)密度、高截留率、長使用壽命的目標(biāo)，培養(yǎng)情況均符合實驗預(yù)期。Cellgard產(chǎn)品能夠為一次性灌流式生物反應(yīng)器的高密度細(xì)胞培養(yǎng)提供有力支撐。應(yīng)當(dāng)注意的是，由于用戶不同的培養(yǎng)工藝可能導(dǎo)致不同的培養(yǎng)結(jié)果，以上兩組實驗數(shù)據(jù)僅供參考，不可視為標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果。
五、邁博瑞Cellgard細(xì)胞截留板的優(yōu)勢
- 利用深層過濾機制，可實現(xiàn)更高密度的細(xì)胞培養(yǎng)，且抗堵塞能力強；
- 更高的機械強度，避免使用過程中出現(xiàn)因機械損傷導(dǎo)致的泄露；
- 特殊的孔徑設(shè)計，避免細(xì)胞泄露前提條件下，對蛋白等目標(biāo)產(chǎn)物幾乎無截留。
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